關(guān)于進境鴕鳥檢疫有關(guān)問題的通知 （動植檢動字〔1996〕87號）

關(guān)于進境鴕鳥檢疫有關(guān)問題的通知

（動植檢動字〔1996〕87號）

各直屬口岸動植物檢疫局、動物檢疫所：

近年來，鴕鳥的引進和繁養(yǎng)在我國呈現(xiàn)了迅猛發(fā)展的勢頭，為滿足引進鴕鳥及其種蛋的需要，一年多來，我們先后與美國、加拿大、法國、荷蘭、津巴布韋、博茨瓦那、澳大利亞和納米比亞簽署了進境鴕鳥的檢疫和衛(wèi)生條件議定書，從而為引進鴕鳥在檢疫方面鋪平了道路。隨著鴕鳥的大量引進，我們的檢疫工作也日趨繁重，而鴕鳥的檢疫在我國還是個嶄新的課題，為總結(jié)近年來進境鴕鳥的檢疫經(jīng)驗，進一步提高檢疫水平，防止疫病隨進口鴕鳥及其種蛋傳入我國，使鴕鳥的檢疫工作更加規(guī)范化和標準化，保證進境鴕鳥檢疫工作的順利進行，現(xiàn)就進境鴕鳥及其種蛋入境后的檢疫工作的有關(guān)問題通知如下：

一、進境鴕鳥檢疫

1.鴕鳥入境后須在口岸動植物檢疫局指定的隔離場所進行為期45天的隔離檢疫，如須延長隔離檢疫時間，須報國家局批準。

2.鴕鳥運抵隔離場一周后，逐只進行采血采樣，并分成兩份，其中一份保存?zhèn)洳椋⒆⒁饩幪枴?/p>

3.隔離檢疫期間的實驗室檢疫項目，主要依照我國與輸出國締結(jié)的鴕鳥檢疫議定書規(guī)定的實驗室檢疫項目進行。如發(fā)生特種情況可做特殊檢疫項目。

4.實驗室檢疫的操作試行程序附后。

二、進境鴕鳥種蛋檢疫

1.進境種蛋的孵化廠須獲得口岸動植物檢疫機關(guān)的認可。

2.進境鴕鳥種蛋在入孵前，須用有效的消毒藥進行熏蒸處理。

3.進境種蛋不得與其他種蛋一同孵化。

4.首次孵出的小鳥須在口岸動植物檢疫機關(guān)認可的場所由口岸檢疫機關(guān)隔離檢疫30天，在此期間采樣并依照我國與輸出國締結(jié)的鴕鳥種蛋的檢疫議定書規(guī)定的項目作實驗室檢疫。

三、其他未盡事宜按《進境動物檢疫管理辦法》執(zhí)行。

四、在執(zhí)行過程中有何問題，請及時上報國家局。

附件：鴕鳥疫病實驗室檢疫操作試行規(guī)程

中華人民共和國動植物檢疫局

一九九六年八月二十六日

鴕鳥沙門氏菌泄殖腔拭子培養(yǎng)規(guī)程（試行）

一、材料：

滅菌棉拭子、緩沖蛋白胨水、亞硒鹽胱氨酸增菌液、膽硫乳瓊脂、三糖鐵瓊脂、生化試驗管、多價血清因子、細菌培養(yǎng)必需設(shè)備。

二、操作方法：用無菌棉拭子從泄殖腔取樣，放無菌瓶中，盡可能冷藏于2～4℃，編號后送實驗室檢驗。

三、實驗室檢驗：

鴕鳥鸚鵡熱間接血凝（IHA）操作規(guī)程（試行）

一、本規(guī)程適用于鴕鳥衣原體病的診斷。

二、材料

衣原體屬抗原致敏綿羊紅細胞

標準陰、陽性對照血清

被檢血清：采集鴕鳥血清，試驗前于56℃水浴滅活30分鐘。

90度V型反應(yīng)板

滅菌生理鹽水

微量加樣器

三、試驗方法

1.將生理鹽水滴于V型反應(yīng)板中，每孔50ul。

2.取被檢血清50ul于第一孔中，與生理鹽水混勻后吸50ul于第二孔，依次作倍比稀釋至1:16。

3.將1:8和1:16兩孔各加25ul抗原，如作定量試驗可根據(jù)實際需要自行決定。

4.對照試驗：設(shè)陽性血清＋抗原、陰性血清＋抗原、生理鹽水＋抗原各一孔。

四、血凝反應(yīng)程度的標準：

“＋＋＋＋”：紅細胞全部凝集，形成一層均勻的膜，布滿整個孔底。

“＋＋＋”：紅細胞在孔底形成一層薄膜，面積比前者稍小。

“＋＋”：紅細胞在孔底形成薄層凝集，邊緣松散或呈鋸齒狀。

“＋”：紅細胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圓點。

“＋”：紅細胞沉于孔底，但周圍不光滑或中心有空斑。

“―”：紅細胞完全沉于孔底，呈光滑的圓點。

“＋＋”以上的凝集判為陽性凝集。

五、結(jié)果判定

1.對照試驗：出現(xiàn)如下結(jié)果試驗方可成立，否則應(yīng)重試，陽性血清＋抗原呈“＋＋＋＋”；陰性血清十抗原呈“-”；抗原十生理鹽水。

2.被檢樣品判定標準：血清效價＞1:8（＋＋）判為陽性。

鴕鳥新城疫、禽流感、付粘病毒分離操作規(guī)程（試行）

本規(guī)程適用于新城疫、禽流感、付粘病毒的分離

一、材料

1.消毒棉拭子

2.滅菌試管

3.滅菌生理鹽水

4.泄殖腔棉拭子保存液：PBS，PH7.2-7.4，青霉素1萬單位/ml，鏈霉素10mg/m1，慶大霉素250ug/ml，制霉素5000u/ml。

5.SPF種蛋。

6.90度V型反應(yīng)板。

7.微量加樣器。

二、操作方法

1.將采集的泄殖腔棉拭子置于樣品保存液中，置4℃過夜。次日3000rpm離心10min，上清液作菌檢后接種9～10日齡雞胚（每胚0.2ml），37℃再孵育5天，去掉24小時死亡的雞胚，其他雞胚放4℃冷卻后，檢測雞胚尿囊液的血凝滴度。如尿囊液的血凝反應(yīng)呈陰性，應(yīng)再用雞胚盲傳2代。

2.將收集的尿囊液用PBS以25ul量進行倍比稀釋，加25ul的1%雞紅細胞，輕輕混勻，靜置15～30min，判定血凝滴度。

如雞胚尿囊液的血凝試驗呈陽性，應(yīng)分別用新城疫病毒、禽流感病毒、副粘病毒的陽性血清作血凝抑制試驗以檢測病毒的種類。

表一　雞胚尿囊液血凝試驗 （單位：ul）（略）

禽流感血凝抑制試驗操作程序（試行）

一、試驗材料

1.抗原：禽流感病素H5、H7型抗原；

2.陰、陽性對照血清。

3.紅細胞：無菌采集雞血液5～10ml于少許阿氏液中搖勻，以洗滌3～5次，每次3000rpm離心10min，將血漿、白細胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細胞稀釋成1%的紅細胞懸浮液（RBC）；

4.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液，離心分離血清，56℃滅活30min；

5.稀釋液：滅菌的生理鹽水或PBS（pH7.2～7.4）

6.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗操作

1.血凝試驗（HA）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表一進行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉?？?1、12不加抗原，只加生理鹽水作空白對照。加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表一　禽流感血凝試驗（單位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)；因此，能使紅細胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)的病毒液25ul稱為1個血凝單位（HA）。如該抗原的血凝單位為1:128/25ul。

在進行禽流感血凝抑制試驗時，病毒的工作濃度應(yīng)為8HA。因為該試驗的抗原的血凝單位為1:128/25ul，按其孔號數(shù)（孔.7）倒退3孔的稀釋倍數(shù)（孔4　1:16），作為該病毒的工作濃度：1:16/25ul。

2.血凝抑制試驗（HI）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表二進行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加待檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉?？?作為陽性血清對照，孔10作為陰性血清對照，孔11不加任何血清而作為抗原對照，孔12不加抗原和任何血清，只加PBS作空白對照。各孔加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

未免疫的健康鴕鳥血清無血凝抑制作用，各稀釋倍數(shù)均出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象；禽流感感染或免疫的鴕鳥血清能抑制禽流感病毒對紅細胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集紅細胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價（如表二的血凝抑制價為1:64）。

表二　禽流感血凝抑制試驗（單位：ul）（略）

3.判定標準

1）判定時應(yīng)首先觀察各對照孔是否完全符合；

2）紅細胞凝集：紅細胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個孔底，判為血凝作用為陽性“十”；

3）無凝集或凝集抑制：紅細胞集中于孔底中央呈點狀，判血凝作用為陰性“―”，或判血凝抑制作用為陽性；

4）血凝抑制價：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀釋倍數(shù)；

5）被檢血清的血凝抑制價在1:8以上者，判為陽性反應(yīng)；

6）最后判定時間與感作時間有關(guān)。溫度高時感作時間短，15min即可；溫度低時可適當延長，但最長不得超過30min。

禽流感瓊脂擴散試驗操作規(guī)程（試行）

1.瓊脂凝膠平板的制備：稱取瓊脂糖1g，氯化鈉8.5g，加入100ml蒸餾水，10磅10分鐘高壓溶解后，冷卻至45℃，加入0.01%疊氮鈉，每個直徑6CM平皿加7ml融化瓊脂，厚度為2.8mm，待凝固后置冰箱內(nèi)片刻。

2.打孔：中間一孔，周圍六孔為一組，孔徑3mm，孔居2.5mm。

3.加樣：中心孔加抗原，周圍1、3、5孔加陽性血清，2、4、6孔加被檢血清。

4.加樣后置濕盒內(nèi)，于室溫下感作。

5.結(jié)果判定：24小時初判，48小時終判，陽性對照成立時，進行判定。

陽性：被檢血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)致密沉淀線，并與標準陽性血清的沉淀線末端互相聯(lián)接。

可疑：標準陽性血清孔和抗原孔之間的沉淀線向被檢血清孔內(nèi)側(cè)彎曲。

陰性：抗原孔與被檢血清孔之間不出現(xiàn)沉淀線或標準陽性血清與陽性孔間的沉淀線向毗鄰的被檢血清孔直伸或其外側(cè)偏彎。

禽副粘病毒血凝抑制試驗操作程序

一、試驗材料

1.抗原：禽副粘病毒病毒Ⅱ型抗原；

2.紅細胞：無菌采集雞血液5～10ml于少許阿氏液中搖勻，以洗滌3～5次，每次3000離心10min，將血漿、白細胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細胞稀釋成1%的紅細胞懸浮液（RBC）；

3.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液，離心分離血清，56℃滅活30min；

4.稀釋液：滅菌的生理鹽水或PBS（pH7.2～7.4）

5.陰、陽性對照血清

6.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗操作

1.血凝試驗（HA）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表一進行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加禽流感抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉?？?1、12不加抗原，只加生理鹽水作空白對照。加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表一　禽副粘病毒血凝試驗（單位：ul）（略）

抗原的血凝滴度是凡能使1%的雞紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)；因此，能使紅細胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)的病毒液25ul稱為1個血凝單位（HA）。如該抗原的血凝單位為1:128/25ul。

在進行禽副粘病毒血凝抑制試驗時，病毒的工作濃度應(yīng)為4HA。因為該試驗的抗原的血凝單位為1:128/25ul，按其孔號數(shù)（孔7）倒退2孔的稀釋倍數(shù)（孔5，1:16），作為該病毒的工作濃度：1:32/25u1。

2.血凝抑制試驗（HI）：

取干凈的微量滴定板（V型）一塊，按表二進行操作：每孔加25ul生理鹽水，孔1加待檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3；如此依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉?？?作為陽性血清對照，孔10作為陰性血清對照，孔11不加任何血清而作為抗原對照，孔12不加抗原和任何血清，只加生理鹽水作空白對照。各孔加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫；每5min觀察一次，15～30min后判定結(jié)果，并作好記錄。

表二　禽副粘病毒血凝抑制試驗（單位：ul）（略）

未免疫的健康鴕鳥血清無血凝抑制作用，各稀釋倍數(shù)均出現(xiàn)紅細胞凝集現(xiàn)象；禽副粘病毒感染或免疫的鴕鳥血清能抑制禽副粘病毒對紅細胞的凝集作用。凡能使8HA的抗原凝集紅細胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價（如表二的血凝抑制價為1:64）。

3.判定標準

1）判定時應(yīng)首先觀察各對照孔是否完全符合；

2）紅細胞凝集：紅細胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個孔底，判為血凝作用為陽性“十”；

3）無凝集或凝集抑制：紅細胞集中于孔底中央呈點狀，判血凝作用為陰性“-”，或判血凝抑制作用為陽性；

4）血凝抑制價：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制的最高血清稀釋倍數(shù)；

5）被檢血清的血凝抑制價在1:8以上者，判為陽性反應(yīng)；

6）最后判定時間與感作時間有關(guān)。溫度高時感作時間短，15min即可；溫度低時可適當延長，但最長不得超過30min。

鴕鳥新城疫血凝抑制試驗操作規(guī)程（試行）

一、試驗材料

1.抗原：選擇對紅細胞凝集作用強的雞新城疫弱毒株接種雞胚，收獲尿囊液和羊水制備。

2.紅細胞：采健康雞血液5～10ml，于少許阿氏液中搖勻，以生理鹽水洗3～5次，每次3000rpm離心5～10分鐘，將血漿、白細胞充分洗去至上清液清亮，再將沉淀的紅細胞用生理鹽水稀釋成1%的紅細胞懸浮液。

3.被檢血清：采集被檢鴕鳥血液分離血清，試驗前56℃滅活30分鐘。

4.生理鹽水：滅菌的生理鹽水或PBS（pH6.5～7.2）。

5.90度V型反應(yīng)板，微量加樣器。

二、試驗操作

1.血凝試驗（HA）：

取干凈的微量血凝反應(yīng)板（V型）一塊，按表一進行操作，每孔加生理鹽水25ul，孔1加鴕鳥新城疫抗原25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次；再吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3，依次稀釋到孔10，孔10混勻后吸出25ul棄掉。孔11、12不加生理鹽水作空白對照。然后加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫，每5分鐘觀察一次，15分鐘后判定結(jié)果并作好記錄。

抗原的血凝價為凡能使紅細胞完全凝集的病毒最高稀釋倍數(shù)，即該病毒的血凝滴度。如表一血凝價為1:128，因此能使雞紅細胞完全凝集的最高稀釋倍數(shù)和病毒液25ul為該病毒的1個血凝單位（HA），在進行血凝抑制試驗時，病毒工作濃度為4HA。如該試驗的病毒血凝價為1:128，按其孔號數(shù)（孔7）倒退兩孔的稀釋倍數(shù)（孔5），即該病毒液作1:32稀釋。

2.血凝抑制試驗（HI）：

取干凈的微量血凝滴定板（V型）一塊，按表二進行操作，每孔加生理鹽水25ul，孔1加被檢血清25ul，用移液器反復(fù)吹打混勻三次，再吸出25ul于孔2，吹打混勻后吸出25ul于孔3，依次稀釋到孔8，孔8混勻后吸出25ul棄掉，孔9作為陽性血清對照，孔10作為陰性血清對照，孔11不加血清作為抗原對照，孔12不加生理鹽水作空白對照。然后各孔加入含4HA的抗原25ul，充分振蕩后室溫靜置感作5～6分鐘；再加入1%的紅細胞懸浮液25ul，充分振蕩后置于室溫，每5分鐘觀察一次，15分鐘后判定結(jié)果，并作好記錄。

健康鴕鳥血清無抑制作用，各稀釋倍數(shù)均無紅細胞凝集現(xiàn)象；感染鴕鳥或免疫鴕鳥血清能抑制對紅細胞的凝集作用，凡能使4HA的抗原凝集紅細胞作用完全抑制的血清最高稀釋倍數(shù)，稱為該血清的血凝抑制價（如表二的血凝抑制價為1:64）。

3.判定標準

1）判定時應(yīng)首先觀察各對照孔是否完全符合。

2）紅細胞凝集：紅細胞分散在孔底四周呈均勻的顆粒狀凝集且布滿整個孔底，判血凝作用為陽性（十）。

表一　新城疫血凝試驗（單位：ul）（略）

表二　新城疫血凝抑制試驗（單位：ul）（略）

3）無凝集或凝集抑制：紅細胞集中于孔底中央呈點狀，判血凝作用為陰性（一），或判血凝抑制作用為陽性。

4）血凝抑制價：凡能使抗原的血凝作用完全受到抑制最高血清稀釋倍數(shù)。

5）被檢血清的血凝抑制價在1：32以上者，判定為陽性反應(yīng)。

6）最后判定時間與感作溫度有關(guān)，溫度高時需要時間短，15分鐘即可，溫度低時可適當延長，但最長不得超過30分鐘。